张旺喆麒/赵瑚CRPS：组织透明化技术：从三维神经环路解析走向多模态研究 | Cel

组织透明化方法经历了持续迭代。早期疏水性方法使用有机溶剂脱水、脱脂并匹配折射率，能够较快处理较大样本，但可能造成组织收缩和荧光减弱。以ScaleS、SeeDB和CUBIC为代表的亲水性方法更有利于保留内源性荧光，而CLARITY等水凝胶方法则通过固定生物分子支持多轮标记。近年的SOLID和VIVIT进一步尝试同时改善透明度、形态保持与成像质量。

不同方法虽然试剂组成不同，目标却具有共同性，即减少组织内部的折射率差异。下图进一步比较了三种具有代表性的物理化学策略：亲水性试剂改变氢键作用并促进水合；两亲性1,2-己二醇可协调脱脂和脱水过程；VIVIT则利用离子液体形成玻璃态，尽量减少形态损伤并保留荧光信号。因此，选择透明化方案时，需要同时考虑成像尺度、荧光兼容性、组织变形及处理效率。

组织透明化不仅涉及去除脂质，还需要处理细胞外基质造成的散射。胶原蛋白由氢键维持稳定的三螺旋结构，会影响光线在组织中的传播。甘油、尿素等含羟基或氨基的小分子能够改变氢键网络，使胶原结构适度松弛，改善试剂渗透和光线透过。

在脑组织中，细胞膜和髓鞘等富脂结构是导致光散射的重要来源。疏水性方法主要借助有机溶剂去除脂质；亲水性方法通常使用SDS或Triton X-100等表面活性剂；水凝胶方法则先固定蛋白质和核酸，再进行脱脂。

水分调节是另一项关键操作。疏水性透明化通常需要先脱水，随后使组织与有机透明化介质实现折射率匹配，因此容易出现一定程度的体积收缩。相比之下，亲水性和水凝胶方法可通过促进水分进入组织来增强透明效果，但也可能引起膨胀。

具体而言，果糖、蔗糖、麦芽糖和尿素等亲水性分子可改变组织内的分子间作用，并利用水合作用促进水及其他小分子进入。水凝胶策略则借助聚丙烯酰胺网络固定部分生物分子，同时维持较强的吸水能力。

除了散射，色素对光的吸收也会影响成像。血红素、黑色素和脂褐素能够削弱光信号，过氧化氢和Quadrol等脱色处理可减少这类干扰。值得注意的是，综述还讨论了另一条方向：以柠檬黄为代表的可逆活体皮肤透明化方法，通过调节组织光学性质改善观察条件。这类活体策略具有新意，但与传统固定组织脱色并不相同，其生物相容性仍需审慎评价。

当组织透明化与光片荧光显微镜、共聚焦成像和连续切片结合后，研究对象便从局部细胞扩展到完整神经系统。下图汇集了PEGASOS、wildDISCO、TESOS、ARCHmap和VIVIT等技术的应用：既可在小鼠全脑中重建长距离轴突，也可显示全身外周神经和免疫细胞分布，并借助分层成像进一步观察精细神经结构。这些方法弥补了大范围覆盖与高分辨率之间的部分技术缺口。

更重要的是，三维成像能够直接追踪疾病相关神经环路。下图展示了多种研究实例，包括丘脑投射、帕金森病相关VTA–CA2环路、癫痫相关脑区连接，以及从前爪皮肤延伸至脊髓的感觉神经。研究还利用全身透明化描绘迷走神经分布、舌部刺激相关觉醒通路及脊髓损伤后的下行通路改变。连续的空间信息有助于为神经活动记录和疾病机制研究提供解剖学依据。

组织透明化的应用还延伸到神经系统与肿瘤之间的相互作用。下图总结了胰腺肿瘤中交感神经纤维增生、肿瘤支配神经元的示踪与单细胞分析、肺腺癌的迷走感觉神经支配，以及脑转移模型的三维成像研究。相比二维切片，这些方法更容易保留肿瘤、血管、神经和周围组织之间的空间联系，从而为理解肿瘤神经重塑及其与疾病进展的关系提供证据。

对于骨骼、牙齿及其他软硬组织交界区域，传统成像同样容易受到光散射和复杂组织结构的限制。下图展示了透明化技术在植入物与组织界面、股骨和下颌骨神经末梢、骨折部位神经纤维，以及骨皮质内胆碱能和肾上腺素能神经分布研究中的应用。由此，研究者能够在较完整的解剖背景下分析骨组织的神经支配及其与损伤修复之间的联系。

获得清晰的三维图像还需要可靠的分子标记。下图比较了传统厚组织标记与透明化整合标记的差异，并归纳抗体免疫标记、转基因荧光蛋白、腺相关病毒介导的细胞特异性标记以及化学荧光染料等策略。将这些方法与透明化技术结合，有助于识别不同神经元和组织成分，但标记深度、均匀性、成本及多轮染色的稳定性依然会影响最终结果。

在图像获取之外，文章还讨论了人工智能、多组学与三维病理的整合方向。大体积光片成像能够产生海量数据，需要自动分割、配准和神经纤维重建工具来提高分析效率。不过，图像分辨率各向异性、跨实验方案的数据差异和高质量标注数据不足，仍会限制现有算法的稳定性。组织透明化与空间转录组、质谱成像等手段结合也很有前景，但当前许多研究主要依赖顺序检测及事后配准，尚不能等同于真正同步的多模态测量。

总体而言，该综述强调，组织透明化正在从单一的组织成像工具发展为连接整体解剖、细胞结构和分子信息的研究平台。下一阶段的重点不仅是获得更透明的样本或更清晰的图像，还在于兼顾组织形态与荧光保留、实现跨尺度结构与功能信息的可靠对应，并建立可重复的操作和数据标准。对于活体透明化及临床应用，仍需进一步解决安全性、成像深度、标准化和质量控制问题，才能使三维观察更有效地服务于神经科学研究及疾病诊疗。

原文刊载于Cell Press细胞出版社

旗下期刊Cell Reports Physical Science，