肠上皮NF-κB的活性及相关基因表达随结肠炎进程发生变化

既往研究已较充分地揭示了NF-κB在免疫细胞中的促炎作用，但其在肠上皮细胞中的功能仍存在争议。为了明确肠上皮NF-κB在结肠炎不同阶段的活化特征，研究者首先使用κEGFP报告小鼠，通过EGFP信号直接反映NF-κB的转录活性，并结合肠上皮细胞标志物E-cadherin，观察其在正常状态、急性结肠炎及恢复期的分布情况。结果显示，正常结肠中仅有不足5%的上皮细胞存在NF-κB活化，主要分布于Ki67阳性的增殖细胞。经DSS诱导急性结肠炎后，残存上皮细胞中约50%出现NF-κB活化；而在恢复期，NF-κB活化则主要出现在CHGA阳性的肠内分泌细胞中。上述结果表明，肠上皮NF-κB的活化具有明显的阶段性，不同炎症阶段参与NF-κB应答的上皮细胞类型也存在差异。

为了进一步了解NF-κB活化后引起的基因表达变化，研究者对正常、急性炎症及恢复期小鼠的结肠组织进行单细胞RNA测序，并比较上皮细胞、免疫细胞和间质细胞中NF-κB相关靶基因的表达特征。结果发现，三类细胞的NF-κB转录反应存在明显差异，共同表达上调的相关靶基因仅有10个，提示即使受到相同的炎症刺激，NF-κB在不同细胞中也可能发挥不同的作用。研究者分析发现，正常状态下，肠上皮NF-κB相关靶基因主要参与基因表达调控和代谢等细胞自身的稳态维持过程；而在急性结肠炎期间，这些基因则更多涉及炎症反应、髓系细胞活化及免疫细胞募集，其中趋化因子Ccl22的表达升高尤为明显。这些结果表明，肠上皮NF-κB不仅在不同炎症阶段活化于不同类型的上皮细胞，其下游转录程序也由维持细胞自身稳态转向调节炎症及与周围免疫细胞的通讯。

图 1. 肠上皮NF-κB的活性随细胞类型和结肠炎阶段发生变化

肠上皮NF-κB活化可减轻结肠炎损伤

为了明确肠上皮NF-κB在结肠炎中的作用，研究者采用了两种功能相反的基因小鼠：ΔNᴵᴱᶜ小鼠通过表达截短型IκBα抑制NF-κB活性，而IκBαᴵᴱᶜ ᴷᴼ小鼠则通过敲除其抑制因子IκBα，使NF-κB持续活化，并分别与同窝对照小鼠进行比较。在1.5% DSS诱导的结肠炎模型中，对照小鼠仅出现轻度炎症，而ΔNᴵᴱᶜ小鼠则表现出明显的体重下降、结肠缩短及黏膜损伤，且停止DSS处理后仍难以恢复。进一步分析发现，ΔNᴵᴱᶜ小鼠的上皮连接结构明显受损，Ki67阳性增殖细胞减少，提示NF-κB受到抑制后，上皮损伤修复能力下降。作为反向验证，研究者使用3% DSS诱导IκBαᴵᴱᶜ ᴷᴼ小鼠发生结肠炎。结果显示，与对照相比，IκBαᴵᴱᶜ ᴷᴼ小鼠的结肠组织损伤明显减轻，炎症评分降低，且正常状态下即可观察到隐窝增生，进一步支持肠上皮NF-κB的保护作用。

为了判断这一保护作用是否直接来自上皮细胞，研究者进一步建立肠道类器官模型。结果发现，IκBαᴵᴱᶜ ᴷᴼ小鼠来源的类器官生长和分化更快，而ΔNᴵᴱᶜ小鼠来源的隐窝则无法正常形成类器官，即使补充WNT信号或成纤维细胞条件培养基也未能恢复其生长。然而，在LPS刺激下，IκBαᴵᴱᶜ ᴷᴼ类器官并未表现出比对照更强的抗损伤能力。这些结果表明，肠上皮NF-κB有助于维持上皮生长和减轻结肠炎损伤，但其在体内的保护作用可能还涉及与周围其他细胞的相互作用。

图2. 抑制肠上皮NF-κB加重结肠炎及上皮再生障碍，而持续活化NF-κB可减轻组织损伤

肠上皮NF-κB活化伴随结肠Treg细胞增多

为了明确肠上皮NF-κB可能影响哪些免疫细胞，研究者利用结肠单细胞RNA测序数据进行CellChat分析。结果显示，正常状态下，上皮细胞的预测通讯主要发生在上皮细胞之间；结肠炎中，其与Treg细胞、γδ T细胞等免疫细胞的潜在联系明显增加。进一步对ΔNᴵᴱᶜ小鼠和同窝对照小鼠的结肠隐窝进行RNA测序，并结合免疫细胞特征进行分析发现，肠上皮NF-κB受到抑制后，中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞相关的转录特征增强，而CD4⁺ T细胞相关特征减少，提示上皮NF-κB可能参与调节肠黏膜免疫细胞的组成。

为了验证上述结果，研究者通过流式细胞术和组织免疫荧光进一步分析结肠局部的免疫细胞变化。结果发现，NF-κB持续活化的IκBαᴵᴱᶜ ᴷᴼ小鼠中，多种Treg细胞亚群明显增多。即使未接受DSS刺激，其远端结肠FoxP3⁺CD4⁺ Treg细胞数量也已超过同窝对照小鼠的6倍，且DSS刺激后未进一步明显增加。与此同时，对照小鼠在结肠炎期间出现的中性粒细胞增多，在IκBαᴵᴱᶜ ᴷᴼ小鼠中并不明显。这些结果表明，肠上皮NF-κB活化可改变结肠局部免疫细胞的组成，其中Treg细胞的富集可能是其减轻肠道炎症的重要原因。

图3. NF-κB活化改变肠上皮与免疫细胞之间的信号联系

图4. 肠上皮NF-κB持续活化后，结肠Treg细胞明显增多

NF-κB持续活化小鼠来源的Treg细胞具有更强的保护作用

肠上皮NF-κB持续活化的小鼠结肠中Treg细胞明显增多，但这些细胞是否具有更强的保护能力仍不清楚。为了验证这一点，研究者分别从野生型小鼠和IκBαᴵᴱᶜ ᴷᴼ小鼠的脾脏及淋巴结中分离CD4⁺CD25⁺ Treg细胞，并将相同数量的细胞过继转移至DSS诱导的结肠炎小鼠。结果显示，两种来源的Treg细胞均能缓解结肠炎，但IκBαᴵᴱᶜ ᴷᴼ小鼠来源的Treg细胞保护效果更明显，受体小鼠体重下降和腹泻程度较轻，结肠缩短及组织学损伤也有所改善。进一步的组织染色发现，接受IκBαᴵᴱᶜ ᴷᴼ小鼠来源Treg细胞的受体小鼠具有更完整的上皮结构，Ki67阳性隐窝增殖细胞也更多，而转移总CD3⁺ T细胞的保护作用相对有限。由于两组Treg细胞的转移数量相同，且均能进入受体结肠，提示其保护效果的差异并非单纯由细胞数量决定。这些结果表明，肠上皮NF-κB持续活化不仅伴随Treg细胞数量增加，还可能增强其抑制炎症和促进黏膜修复的能力。

图5. Treg细胞过继转移证实其在减轻结肠炎中的保护作用

肠上皮来源CCL22促进Treg细胞迁移

研究者进一步比较了野生型和IκBαᴵᴱᶜ ᴷᴼ小鼠来源肠道类器官的分泌组，发现多种细胞因子及趋化因子发生变化。进一步通过Transwell实验发现，CCL22和CCL5均能够促进Treg细胞迁移。组织染色显示，除了免疫细胞，肠上皮细胞同样能够表达CCL22，且其表达在DSS诱导结肠炎后明显升高；而在IκBαᴵᴱᶜ ᴷᴼ小鼠中，即使未发生炎症，上皮细胞也已表现出较高水平的CCL22表达。为了进一步验证CCL22在Treg细胞募集中的作用，研究者利用野生型和Ccl22缺失小鼠来源的肠道类器官，比较LPS刺激后条件培养基对Treg细胞迁移的影响。结果发现，野生型类器官的条件培养基能够明显促进Treg细胞迁移，而缺失Ccl22后，这种趋化作用基本消失。肠上皮来源的CCL22是促进Treg细胞迁移的重要趋化信号，可能介导肠上皮NF-κB活化与结肠Treg细胞富集之间的联系。

肠上皮分泌信号促进Treg细胞增殖及抗炎反应

研究者利用IκBαᴵᴱᶜ ᴷᴼ小鼠来源类器官的条件培养基处理Treg细胞，探究肠上皮分泌物对Treg细胞功能的影响，结果发现Treg细胞增殖增加，趋化因子受体CCR4表达也明显升高。进一步分析发现，IL-33和双调蛋白 (amphiregulin) 均能够促进Treg细胞增殖和存活，并增加CCR4表达。此外，IκBαᴵᴱᶜ ᴷᴼ小鼠结肠来源的Treg细胞在短期培养时，IL-10分泌量超过野生型来源细胞的100倍，但这一差异随培养时间延长逐渐减弱，提示Treg细胞较强的抗炎反应可能与局部上皮环境的持续支持有关。单细胞RNA测序还发现，IκBαᴵᴱᶜ ᴷᴼ小鼠的Treg细胞中GDPD3、FTL1等代谢相关基因表达升高。组织免疫荧光证实，结肠Treg细胞中GDPD3表达增加，而使用上述类器官条件培养基处理正常Treg细胞，同样能够诱导GDPD3表达。此外，部分GDPD3高表达的脾脏Treg细胞还表现出较高的CCR9、GPR15等肠道归巢相关受体表达。这些结果表明，肠上皮NF-κB持续活化产生的分泌信号不仅能够促进Treg细胞增殖，还可增强其抗炎反应，并影响与肠道归巢相关的分子特征。

图 6. 上皮来源的CCL22及其他分泌因子影响Treg细胞的迁移和功能

UC患者肠上皮NF-κB转录程序及免疫调节功能异常

为了了解肠上皮NF-κB相关变化是否同样存在于UC患者，研究者分析了健康对照及UC患者非炎症、炎症结肠区域的公开单细胞RNA测序数据。结果发现，UC患者肠上皮中的NF-κB靶基因并非一致上调，而是部分促炎基因表达增强，与代谢调控、干细胞维持等相关的基因表达下降，RELA/NFKB1相关转录调控网络也发生改变。为了进一步验证UC肠上皮的功能变化，研究者利用健康对照和UC患者的结肠活检组织建立类器官。两组类器官在正常条件下生长相近，但LPS刺激后，UC来源类器官的细胞凋亡明显增加。进一步使用TNF刺激发现，健康对照类器官中TNF、LCN2和CXCL1等分泌因子明显增加，而UC类器官中部分因子在刺激前已处于较高水平，刺激后却未进一步升高，甚至出现下降。此外，研究者利用类器官条件培养基进行Jurkat T细胞迁移实验，发现只有TNF刺激后的健康对照类器官培养基能够明显促进T细胞迁移。UC患者肠上皮NF-κB相关转录程序发生失衡，同时伴随炎症应答异常及T细胞趋化能力下降，提示肠上皮介导的局部免疫调节功能受到影响。

图7. UC患者肠上皮NF-κB转录程序失衡，炎症应答及T细胞趋化功能异常

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