Cell Reports: 从拟南芥到水稻——调控脯氨酸转运提升植物再生潜力 | C

伤口诱导的脯氨酸转运限制植物再生

脯氨酸不仅是构成蛋白质的氨基酸，也是参与植物胁迫适应的重要代谢物。它的合成、降解和跨膜运输共同影响细胞代谢、氧化还原平衡与渗透调节。植物通过专门的脯氨酸转运蛋白调节脯氨酸在不同组织和细胞区域中的分布，但这种运输过程如何影响损伤后的组织再生，此前并不清楚。

研究团队以拟南芥叶片外植体的从头根再生为模型。该过程不需要添加外源植物激素，切下的叶片可以在伤口处启动细胞命运转换，并逐步形成新的不定根。实验显示，外源添加L-脯氨酸会抑制不定根形成，并降低根创始细胞标志基因WOX11在伤口处的表达。当L-脯氨酸浓度达到10 mM时，不定根形成被完全阻断，说明脯氨酸水平能够显著影响伤口处细胞获得再生能力的过程。

随后，研究人员对拟南芥ProT家族的三个成员进行了比较。结果显示，ProT2和ProT3在叶片切割后受到伤口诱导，其中ProT3在切割一天后的伤口处明显表达；相比之下，ProT1的表达主要局限于维管组织，没有表现出相同的伤口诱导特征。缺失ProT2或ProT3均能增强从头根再生，而缺失ProT1没有产生显著影响，表明这些序列相近的转运蛋白在植物再生过程中具有不同功能。

prot3突变体不仅形成了更多不定根，还在伤口处产生了面积更大的愈伤组织。与此相反，过量表达ProT3会降低从头根再生能力，并抑制伤口处WOX11的表达。这些结果共同表明，ProT2和ProT3是伤口诱导再生的负调节因子，而ProT3可能在根创始细胞建立之前的早期伤口响应阶段发挥作用。

ProT3通过运输脯氨酸影响再生能力

为了确认ProT2和ProT3是否具有直接运输脯氨酸的能力，研究人员利用非洲爪蟾卵母细胞表达系统开展转运和电生理实验。结果显示，表达ProT2或ProT3的卵母细胞能够在酸性条件下摄取外源脯氨酸，并产生明显的脯氨酸诱导内向电流，说明两种蛋白介导的脯氨酸输入受到跨膜质子梯度驱动。

在较低浓度的外源脯氨酸处理下，prot3突变体不再表现出野生型植物所具有的再生抑制反应，说明ProT3的转运活性是脯氨酸限制从头根再生的重要基础。ProT3可能通过促进伤口处细胞摄取脯氨酸，改变局部代谢和氧化还原状态，进而抑制根创始细胞的建立。

研究团队进一步测试了小分子LQFM215。结构预测结果显示，LQFM215可能进入ProT2和ProT3的底物结合区域，其预测结合位置与脯氨酸的结合位点高度重叠，提示该分子可能通过竞争底物结合位点抑制脯氨酸运输。电生理实验进一步证实，LQFM215能够显著降低ProT2和ProT3介导的脯氨酸诱导电流，支持其作为植物脯氨酸转运抑制剂的作用。

在拟南芥叶片外植体中，低至1 μM的LQFM215便可使从头根再生提高约20%，并缓解外源脯氨酸造成的再生抑制。LQFM215能够促进野生型植物的再生，却不能进一步增强prot3突变体的再生能力，说明其促进作用主要依赖ProT3相关通路。无论通过遗传方式破坏ProT功能，还是通过小分子抑制脯氨酸运输，都可以提高叶片外植体形成不定根的能力。

在维持水杨酸防御反应的同时解除再生抑制

进一步实验显示，ProT2和ProT3参与水杨酸对再生的抑制。外源水杨酸类似物NaSA能够显著降低野生型拟南芥的从头根再生水平，而prot2和prot3突变体对这一抑制作用的敏感性下降。LQFM215同样可以缓解NaSA造成的再生缺陷，并部分恢复内源水杨酸水平升高的转基因植物形成不定根的能力。

研究人员还发现，在内源水杨酸水平降低的植物中，外源脯氨酸对再生的抑制作用也随之减弱。这些结果提示，水杨酸与脯氨酸转运可能协同限制从头根再生。不过，目前的实验尚未证明水杨酸与ProT2、ProT3之间存在直接的调控关系，脯氨酸转运可能位于水杨酸信号下游，也可能通过平行通路共同影响伤口处的细胞状态。

ProT3并不控制所有免疫信号对再生的影响。无论使用能够激活模式触发免疫的细菌，还是使用细菌鞭毛蛋白来源的免疫诱导肽flg22，都可以在野生型和prot3突变体中抑制从头根再生。这说明免疫反应能够通过多条通路限制植物再生，而ProT3主要参与其中与水杨酸相关的调节分支。

这项研究的重要发现之一，是解除水杨酸对再生的抑制，并未消除实验中检测的水杨酸防御反应。水杨酸处理后，prot3突变体中的防御相关基因PR1和SARD1仍能正常响应；使用水杨酸类似物BTH预处理后，野生型、prot2和 prot3植物中的细菌生长均受到抑制。因此，在本研究所采用的实验条件和检测指标下，缺失ProT2或ProT3能够减轻水杨酸造成的再生损失，同时没有明显削弱水杨酸响应基因的表达或BTH介导的抗细菌能力。

ProT3–CPK1模块调节伤口处的活性氧平衡

在进一步探索ProT3的作用机制时，研究团队鉴定出其互作蛋白CPK1，并通过双分子荧光互补和免疫共沉淀实验验证了两种蛋白之间的物理互作。两个独立的cpk1突变体均表现出更强的从头根再生和伤口诱导愈伤组织形成能力，与prot3突变体的表型相似。遗传分析显示，ProT3与CPK1部分协同抑制再生，但两种蛋白也可能通过不依赖彼此互作的机制影响这一过程。

这一蛋白模块的作用与活性氧稳态密切相关。植物组织受到损伤后会迅速积累活性氧，早期活性氧信号有助于启动伤口响应和再生程序，但持续或过量的活性氧积累可能反过来抑制组织再生。研究发现，叶片刚被切割时，野生型与prot3 cpk1双突变体伤口处的活性氧水平没有明显差异；切割一天后，双突变体中的活性氧积累显著降低。LQFM215处理也降低了这一阶段伤口处的活性氧水平。

外源过氧化氢实验进一步揭示了活性氧作用的时间依赖性。在切割后立即施加过氧化氢可以促进野生型植物的从头根再生，但在切割一天后进行相同处理，则使生根率下降约15%。这说明适量的早期活性氧信号可能有助于启动再生，而在后续阶段，活性氧水平需要及时降低，才能为根创始细胞建立和器官形成创造适宜的氧化还原环境。

基于这些结果，研究提出了脯氨酸运输连接水杨酸信号、活性氧稳态和再生能力的调控模型。植物受伤后，ProT2和ProT3的表达受到诱导，ProT3与CPK1共同影响伤口处的活性氧动态。ProT3–CPK1模块维持较高的后期活性氧水平，从而限制植物从伤口响应阶段进一步转入组织再生阶段。阻断脯氨酸运输则能够降低后期活性氧积累，为受损细胞重新获得再生能力提供更加适宜的环境。

从拟南芥拓展至多种作物

研究团队进一步在番茄、烟草和水稻中测试了LQFM215对植物再生的影响。在番茄中，LQFM215处理增加了下胚轴外植体形成的愈伤组织面积，并促进叶片外植体产生更多不定根；在烟草叶盘中，LQFM215提高了芽再生效率和每个外植体形成的芽数；在日本晴水稻中，LQFM215促进了盾片来源愈伤组织的增殖。

这些结果表明，化学抑制脯氨酸转运能够促进多种植物和多种类型的再生过程，其作用并不局限于拟南芥的从头根再生。植物组织培养和遗传转化高度依赖愈伤组织形成与器官再生，但部分具有重要农艺性状的品种再生能力较低，限制了育种和基因工程的效率。脯氨酸转运因而可能成为连接植物胁迫响应与再生能力的可调节节点。

不过，现有结果尚不足以证明LQFM215在不同植物中的促进作用均由ProT介导。其在番茄、烟草和水稻中的直接分子靶点、最佳使用浓度与处理窗口，以及对完整植株生长、发育和抗病性的长期影响，都需要进一步研究。本研究展示的是脯氨酸转运抑制剂改善植物再生的实验潜力，尚不能直接等同于已经成熟的作物育种或农业应用技术。

在植物防御与再生之间建立更精细的平衡

这项研究将脯氨酸从一种参与胁迫适应的代谢物，进一步拓展为协调植物免疫与再生的调节节点。ProT2和ProT3并非水杨酸免疫反应的简单开关，而是参与其中与再生抑制相关的特定分支。通过靶向脯氨酸转运，研究人员在实验条件下部分分离了水杨酸介导的免疫激活与再生抑制，为理解植物如何在环境压力下分配防御和修复资源提供了新的机制框架。

这项工作仍留下了一些有待解决的问题。目前，伤口处具备再生能力的细胞中，脯氨酸的局部积累和运输通量尚未得到直接测量；ProT3与CPK1互作如何影响两种蛋白各自的分子功能，也没有完全阐明。此外，研究尚不能排除其他脯氨酸转运途径、ProT运输的其他底物，以及脯氨酸作为代谢底物或渗透调节物参与再生的可能性。

尽管如此，这项研究提供了一种值得关注的思路。通过精细调节代谢物运输和损伤后的氧化还原环境，植物的免疫防御与组织再生并非只能此消彼长。随着这一机制在更多作物、品种和再生体系中得到遗传学与药理学验证，脯氨酸转运有望成为改善植物组织培养、遗传转化和作物再生效率的潜在干预方向。