虚实结合多层级筛选：山东大学团队靶向N蛋白相分离发掘抗冠状病毒先导分子

近日，山东大学药学院展鹏、刘新泳团队联合韩国化学技术研究院Meehyein Kim团队，在Journal of Advanced Research发表研究，通过计算虚拟筛选与多维度生化、细胞、动物实验虚实结合的多层级筛选策略，报道靶向SARS-CoV-2核衣壳（N）蛋白相分离的小分子先导物，为开发非酶靶点的抗冠状病毒候选分子提供新骨架。

尽管新冠已不再构成全球关注的公共卫生紧急事件，但SARS-CoV-2仍在人群持续流行，变异株不断出现。当前临床应用的抗新冠药物，主要靶向主蛋白酶、RdRp这类病毒酶。病毒持续突变产生的耐药风险，会不断压缩现有药物的适用空间。因此，发展机制差异化的抗病毒小分子，是冠状病毒药物研发值得重视的方向。

液-液相分离（LLPS）是近年病毒生物学的研究热点。SARS-CoV-2核衣壳N蛋白能够结合病毒RNA发生相分离，在胞内形成无膜凝聚体；该凝聚体参与病毒RNA复制、基因组包装，还参与介导宿主免疫逃逸，是有潜力的抗病毒干预靶点。

该研究以N蛋白NTD-RNA复合物晶体结构（PDB:7XWZ）为起点，选取N-NTD与RNA的结合界面口袋开展基于结构的虚拟筛选。研究对ChemDiv百万级化合物库进行多轮筛选，经过Glide分子对接、MM-GBSA结合能重打分、聚类与类药性过滤，得到23个候选小分子。通过SPR表面等离子体共振测定蛋白结合能力，叠加细胞水平抗病毒表型评价，得到初筛命中分子D21。

分子动力学模拟提示：D21结合于N-NTD与RNA的作用界面，但仅占据部分口袋，口袋仍留有可供改造的空腔。研究团队以槲皮素、杨梅素黄酮母核为起点，通过酯化修饰构建I、II两个系列共16个衍生物，开展亲和力与抗病毒活性的迭代优化。

在衍生物中，II8综合表现最优：

✅ SPR测定II8对N蛋白解离常数K_d = 1.84 μM，相比初筛分子D21亲和力提升约14倍；

✅细胞活性：Vero细胞EC₅₀ = 26.6 μM；人源Calu‑3肺上皮细胞EC₅₀ = 7.71 μM，CC₅₀＞100 μM，细胞毒性低；

✅细胞机制实验：Western blot、qRT‑PCR结果显示，II8可以剂量依赖性下调细胞内N蛋白水平，降低子代病毒RNA释放；FRAP光漂白恢复、细胞成像实验证实，10 μM浓度条件下，II8能够显著抑制N‑EGFP蛋白形成的相分离凝聚体的尺寸与数量。

✅体内模型：采用hACE2转基因小鼠，将II8和病毒预先共孵育后进行滴鼻感染，后续连续4天鼻腔局部给药。在5、10、20 mg/kg/day各剂量组，小鼠体重维持稳定，全部实现100%生存。值得注意：该模型评价的是局部预防性保护效果，并非病毒感染后的全身治疗。

同时研究也明确指出先导物的现实短板：II8体内代谢清除快，小鼠静脉注射消除半衰期仅0.716 h，口服暴露不足，不适合静脉或口服全身给药；现阶段更适合鼻腔局部预防的先导骨架，后续仍需要开展骨架改造，改善代谢稳定性与成药性。

研究局限提示：文中关键结合位点氨基酸的突变效应仅来自计算模拟，尚未完成突变蛋白的SPR生化实验验证，相关结合机制还需要进一步生化实验确证。

本研究不针对病毒蛋白酶、聚合酶等经典酶靶点，选择干预N蛋白-RNA液-液相分离过程，为应对病毒变异耐药提供了差异化研发思路；也验证了相分离调控小分子用于冠状病毒呼吸道局部预防的可行性，为鼻喷类抗冠状病毒先导药物开发提供新的化学起点。

山东大学药学院为论文第一完成单位，展鹏教授、刘新泳教授、韩国化学技术研究院Meehyein Kim教授为共同通讯作者。本研究得到国家自然科学基金、山东省自然科学基金、科技部重点研发计划、广东省基础与应用基础研究基金以及韩国国家研究基金会等项目资助。

文章链接：https://doi.org/10.1016/j.jare.2026.10.059

编辑：吃一口小猫